Molecular detection of SARS-CoV-2 in Argentina: Evaluation of alternative diagnostic tools for the decentralization of the diagnosis

Abstract The rocketing number of COVID-19 cases highlighted the critical role that diagnostic tests play in medical and public health decision-making to contain and mitigate the SARS-CoV-2 pandemic. This study reports the evaluation and implementation of different tests for the molecular detection of SARS-CoV-2 in the central region of Argentina. We evaluated 3 real time RT-PCR kits (GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit, DisCoVery SARS-CoV-2 RT-PCR Detection Kit and WGene SARS-CoV-2 RT Detection), 2 nucleic acid extraction methods [MagaBio plus Virus DNA/RNA Purification Kit II (BioFlux), 35-min vs. 9-min, a pre-analytical reagent (FlashPrep®) and 2 isothermal amplification tests (Neokit Plus and ELA CHEMSTRIP®). The order according to the best performance of the 3 real-time RT-PCR kits evaluated was: DisCoVery > GeneFinderTM> WGene. The 2 RNA extraction methods showed similar good results: MagaBio plus Virus RNA Purification Kit II (BioFlux) 9-min was selected due to its faster performance. FlashPrep® reagent showed excellent results to perform direct RNA detection. Isothermal amplification assays showed acceptable sensitivity and specificity values (>80%), except in samples with Ct> 30. Our data show optimal real time RT-PCR kits and alternative molecular methods for SARS-CoV-2 diagnostic. These alternative assays proved to be aceptable.

Resumen La explosión de casos de COVID-19 resaltó el papel fundamental que desempeñan las pruebas de diagnóstico en la toma de decisiones médicas y de salud pública para contener y mitigar la pandemia de SARS-CoV-2. Este estudio reporta la evaluación y la implementación de diferentes test para la detección molecular de SARS-CoV-2 en la región central de Argentina. Evaluamos tres kits de RT-PCR en tiempo real (GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit, DisCoVery SARS-CoV-2 RT-PCR Detection Kit y WGene SARS-CoV-2 RT Detection), dos métodos de extracción de ácidos nucleicos (MagaBio plus Virus DNA/RNA Purification Kit II [BioFlux, 35-min vs. 9-min), un reactivo pre-analítico (FlashPrep®) y dos test de amplificación isotérmica (Neokit Plus and ELA CHEMSTRIP®). El orden de rendimiento de los tres kits de RT-PCR en tiempo real evaluados fue el siguiente: DisCoVery GeneFinder™ WGene. Los dos métodos de extracción de RNA mostraron buenos y similares resultados; se seleccionó MagaBio plus Virus RNA Purification Kit II (BioFlux) 9-min debido a su rápido tiempo de procesamiento. El reactivo FlashPrep® mostró excelentes resultados para realizar detección directa de RNA. Los ensayos de amplificación isotérmica mostraron valores de sensibilidad y de especificidad aceptables (80%), excepto en muestras con Ct 30. Nuestros resultados muestran kits de RT-PCR en tiempo real óptimos, como así también métodos moleculares alternativos para el diagnóstico de SARS-CoV-2 que resultan aceptables para su uso en contextos adversos, de descentralización y en diferentes escenarios epidemiológicos, para la detección rápida y precisa del SARS-CoV-2.

Optimización del control interno de calidad de RT-PCR en tiempo real para detección cualitativa de SARS-CoV-2

Objetivo: Optimizar el control interno de calidad de RT-PCR en tiempo real para detección cualitativa de SARS-CoV-2, utilizando los valores Cq de controles negativos y positivos. Material y método: Estudio prospectivo-longitudinal. La muestra estuvo constituida por 143 valores Cq para los controles negativos de alicuotado y extracción, así como para el control positivo. Se analizó la distribución normal de los valores Cq mediante la prueba de Anderson-Darling (AD) y se aplicaron pruebas de aleatoriedad. Se calculó límites de control a partir de 51 valores Cq, para luego, mediante gráficas de control, monitorizar 92 valores Cq obtenidos desde noviembre del 2020 hasta marzo del 2021. Se evaluó aceptación de lote e índices Cpk como indicadores de optimización. Los cálculos se hicieron con el programa Minitab. Resultados: Se aceptaron los lotes de valores Cq y se obtuvieron índices Cpk superiores a 1.33 para los tres tipos de control. Discusión: No existen estudios publicados que apliquen control estadístico de calidad a la detección cualitativa de SARS-CoV-2. Conclusiones: Es posible utilizar los valores Cq de los controles para optimizar el control interno de calidad de RT-PCR en tiempo real para detección cualitativa de SARS-CoV-2, como si se tratara de una técnica de tipo cuantitativo.

Objective: To optimize the internal quality control of real-time RT-PCR for the qualitative detection of SARS-CoV-2, using the Cq values ​​of negative and positive controls. Material and method : Prospective-longitudinal study. The sample consisted of 143 Cq values for the negative aliquot and extraction controls, as well as for the positive control. The normal distribution of Cq values ​​was analyzed using the Anderson-Darling (AD) test and randomness tests were applied. Control limits were calculated from 51 Cq values, and then, using control charts, to monitor 92 Cq values ​​obtained from November 2020 to March 2021. Lot acceptance and Cpk indices were evaluated as optimization indicators. The calculations were made with the Minitab program. Results: The batches of Cq values ​​were accepted and Cpk indices higher than 1.33 were obtained for the three types of control. Discussion : There are no published studies that apply statistical quality control to the qualitative detection of SARS-CoV-2. Conclusions : It is possible to use the Cq values ​​of the controls to optimize the internal quality control of real-time RT-PCR for qualitative detection of SARS-CoV-2, as if it were a quantitative technique.

Diagnóstico molecular del SARS-CoV-2 en los Laboratorios LIORAD-AICA+: experiencia de un año de trabajo / Molecular diagnosis of SARS-CoV-2 at LIORAD-AICA+ laboratories, a one-year work experience

Introducción: El aumento de los casos de COVID-19 en Cuba requirió el desarrollo de nuevas capacidades para el diagnóstico molecular de la infección. En la Unidad Empresarial de Base Laboratorios LIORAD-AICA+, de La Habana, se estableció un Laboratorio de Biología Molecular para el diagnóstico molecular de la enfermedad. Objetivo: Analizar la experiencia de un año de trabajo, en el diagnóstico molecular de la COVID-19, del Laboratorio de Biología Molecular de la UEB LIORAD. Métodos: Para iniciar el diagnóstico molecular del SARS-CoV-2 en la UEB Laboratorios LIORAD se llevó a cabo un conjunto de acciones que estuvieron dirigidas a la evaluación de los riesgos, establecimiento de las áreas y el flujo de trabajo, y formación de equipos de trabajo. El personal se capacitó, se modificaron y elaboraron procedimientos e instructivas. Resultados: La evaluación de los riesgos permitió detectar un conjunto de riesgos asociados a la actividad de diagnóstico y se establecieron las medidas para mitigarlos. El personal del laboratorio recibió un total de 23 capacitaciones, se elaboró un total de ocho procedimientos e instructivas y dos registros. El laboratorio procesó en un año un total de 125 154 muestras. Conclusiones: Durante el año de trabajo el Laboratorio de Biología Molecular de la UEB LIORAD se realizó el diagnóstico certero de la enfermedad. Esto evidencia la importancia de la capacitación del personal y el cumplimiento de las buenas prácticas y medidas de bioseguridad en el trabajo con muestras potencialmente infecciosas(AU)

Introduction: The increase in the number of cases of COVID-19 in Cuba demanded of new capacities for the molecular diagnosis of the infection. A Laboratory of Molecular Biology for the molecular diagnosis of this disease was installed at the Base Business Unit LIORAD-AICA+ Laboratories in Havana. Objective: To analyze a one-year work experience in the molecular diagnosis of COVID-19 at the Laboratory of Molecular Biology, LIORAD-AICA+. Methods: To begin with the molecular diagnosis of SARS-CoV-2 at LIORAD-AICA+, a group of actions were carried out aimed at evaluating the risks, establishing the working areas and flow, and training the work team. Personnel were trained, and procedures and guidelines were drawn up and modified. Results: Risk assessment allowed identifying several risks associated with the diagnostic activity, and measures were established to mitigate them. The laboratory personnel received 23 training sessions; and eight procedures and guidelines, and two registers were drawn up. The laboratory processed a total of 125 154 samples in a year. Conclusions: During the work year, the accurate diagnosis of the disease was conducted at the Laboratory of Molecular Biology, LIORAD-AICA+. This evidences the importance of personnel training and the compliance with good practices and biosafety measures when working with potentially infectious samples(AU)

Estudio del desempeño de dos métodos de detección de antígenos rápidos en hisopados combinados y en hisopados nasofaríngeos para la detección de SARS-CoV-2 / Performance study of two rapid antigen detection methods in combined swabs and nasopharyngeal swabs for detection of SARS-CoV-2

Resumen Se realizó una comparación del desempeño de los métodos rápidos de detección de antígenos para el diagnóstico de SARS-CoV-2 Veritor System de Becton Dickinson y Panbio de Abbott versus una reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción en tiempo real (RT-PCR) de Roche en un triage de demanda espontánea de pacientes febriles de un hospital público, para la detección de COVID-19. Se procesaron 36 hisopados de pacientes sospechosos por los tres métodos. La concordancia entre ambos métodos con la RT-PCR fue del 97%. La sensibilidad de los métodos de detección de antígenos versus la RT-PCR fue del 83% y la especificidad fue del 100%. El valor predictivo positivo (VPP) fue del 100% y el valor predictivo negativo (VPN) fue del 97%. La muestra que resultó discordante presentó un ciclo umbral (Ct) de 29,8. El método para detección de antígenos tuvo un desempeño aceptable, incluso con resultados de sensibilidad mayores que los declarados por los fabricantes (84% para el Veritor System y 93,3% para el Panbio).

Abstract A comparison of the performance of the rapid antigen detection methods for the diagnosis of SARS-CoV-2 Veritor System from Becton Dickinson and Panbio from Abbott versus a real-time polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR) Roche in a spontaneous demand triage of febrile patients of a public hospital was made, for the detection of COVID-19. Thirty six swabs from suspected patients were processed by the three methods. The concordance between both methods with RT-PCR real time was 97%. The sensitivity of the antigen detection methods versus RT-PCR real time was 83% and specificity was 100%. The positive predictive value (PPV) was 100% and the negative predictive value (NPV) was 97%. The sample that was discordant presented a threshold point (Ct) of 29.8. The method for antigen detection resulted in an acceptable performance, even with S results higher than those declared by the manufacturers (84% for the Veritor System and 93.3% for the Panbio).

Resumo Uma comparação do desempenho dos métodos rápidos de detecção de antígenos para o diagnóstico deSARS-CoV-2 Veritor System de Becton Dickinson e Panbio de Abbott versus uma reação em cadeia da polimerasecom transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) da Roche em uma triagem de demanda espontâneade pacientes febris de um hospital público, para a detecção de COVID-19. Foram processadas 36 amostrasde esfregaços de pacientes suspeitos pelos três métodos e a concordância entre os dois métodos com aRT-PCR foi de 97%. A sensibilidade dos métodos de detecção de antigenos versus a RT-PCR foi de 83% ea especificidade de 100%. O valor preditivo positivo (VPP) foi de 100% e o valor preditivo negativo (VPN)foi de 97%. A amostra que resultou discordante apresentou um ciclo limiar (Ct) de 29,8. O método paradetecção de antígenos teve um desempenho aceitável, mesmo com resultados de sensibilidade superioresaos declarados pelos fabricantes (84% para o Veritor System e 93,3% para o Panbio).

Rhinovirus detection by real-time RT-PCR in children with acute respiratory infection in Buenos Aires, Argentina / Detección de rinovirus por RT-PCR en tiempo real en muestras respiratorias de niños de Buenos Aires, Argentina

Human rhinoviruses (HRV), the major cause of common colds, have a significant genetic diversity and are classified into 3 species (A, B, C) with more than 100 serotypes. HRV species C, described in 2006, can only be detected using molecular methods. The objectives of this paper were to adapt a real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for HRV detection and to further determine the frequency of HRV in respiratory samples from children under 2 years of age, with acute respiratory infection (ARI), from Buenos Aires, Argentina. Two real-time RT-PCR assays amplifying the 207 base pair of the 5' non-coding region were compared. The original protocol includes locked nucleic acid analogues and a pyrimidine derivative in the forward primer, while the adapted protocol avoided those molecules. Of 67 respiratory samples, 17 (25.4 %) were positive with the original protocol, and 20 (29.9 %) with the adapted one. Discrepant results were confirmed by sequencing analysis. An expanded gold standard was defined to determine the performance of both assays, and was used to describe the clinical characteristics of positive patients. Better sensitivity and specificity were obtained with the adapted protocol. Considering the expanded gold standard, HRV were detected in 23/67 (34.3 %) patients with ARI: 8/18 (44.4%) outpatients and 15/49 (30.6 %) hospitalized. Wheezing episodes were more frequent in HRV positive patients (43.5 %) than in HRV negative patients (18.2 %) (p = 0.041). This study describes the utility and clinical sensitivity of an adapted real-time RT-PCR assay for HRV detection.

Los rinovirus humanos (RVH) constituyen la principal causa de resfrío común y poseen una gran diversidad genética, con más de 100 serotipos clasificados en tres especies (A, B, C). Los RVH C fueron descritos en 2006 y solo pueden detectarse utilizando métodos moleculares. El objetivo del presente trabajo fue adaptar un protocolo de transcripción reversa seguida de reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) en tiempo real para detectar RVH y posteriormente determinar su frecuencia en muestras de niños menores de 2 años con infección respiratoria aguda (IRA). Se compararon dos protocolos de RT-PCR en tiempo real, que amplifican 207 pares de bases de la región 5' no codificante. El protocolo original incluyó un cebador directo con análogos de nucleótidos bloqueados (LNA) y un derivado pirimidínico en su secuencia, mientras que el protocolo adaptado no los incluyó. De 67 muestras, 17 (25,4 %) fueron positivas con el protocolo original y 20 (29,9 %) con el protocolo adaptado; los resultados discrepantes se confirmaron por secuenciación. Se definió un gold standard expandido para determinar el desempeño de ambos ensayos y describir las características clínicas de los pacientes RVH positivos. La mejor sensibilidad y especificidad se obtuvo con el protocolo adaptado. Considerando el gold standard expandido, se detectó RVH en 23/67 (34,3 %) pacientes con IRA: 44,4 % (8/18) ambulatorios y 30,6 % (15/49) internados. Los episodios de sibilancias fueron más frecuentes en pacientes RVH positivos (43,5 %) que en RVH negativos (18,2 %) (p = 0,041). El presente estudio describe la utilidad y la sensibilidad clínica de esta RT-PCR en tiempo real adaptada para detectar RVH.